Disertante

Celeste Pérez

Resumen

El herpesvirus humano-8 (HHV-8) fue identificado en 1994 en biopsias de sarcoma de Kaposi (SK) de pacientes con SIDA. Pertenece a la familia Herpesviridae, subfamilia Gammaherpesvirinae, género Rhadinovirus. El virus puede permanecer en las células en estado latente como episoma, expresando una mínima cantidad de genes virales. Los genomas latentes se convierten en líticos luego de una estimulación adecuada, dando lugar a la transcripción de los genes necesarios para producir virus infectivo. El HHV-8 está asociado etiológicamente a SK, la enfermedad multicéntrica de Castleman (EMC) y linfoma primario de efusiones (PEL). La prevalencia de la infección está relacionada con factores geográficos y de riesgo (portador de VIH, adicción a drogas endovenosas, homosexuales, entre otros). La tasa de infección es alta (≥20 %) en África, intermedia (5-20 %) en algunas zonas de Europa y baja (0-5 %) en el Norte de Europa, Asia, Estados Unidos y Sudamérica, con diferencias regionales (>50 %) en áreas de baja prevalencia. La mayoría de los estudios de seroprevalencia se basan en la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI); otros ensayos serológicos son eficaces para detectar anticuerpos en pacientes con enfermedades asociadas, pero no tanto en la evaluación de la población general. La infección por HHV-8 puede identificarse por PCR utilizando el fragmento de 233 pb del OFR 26. El análisis filogenético basado en el ORF K1, ha permitido la clasificación de seis subtipos (A-F), con variantes cuyos cambios se correlacionan con ancestros étnicos y geográficos.

Este trabajo aborda diversos aspectos de la infección por el HHV-8, incluyendo desarrollos metodológicos para su análisis y estudios de prevalencias de anticuerpos y genotipos, en diferentes poblaciones de Argentina y países limítrofes.

Se analizaron muestras de 3345 donantes de sangre, 356 pacientes de un centro de atención VIH y 188 pacientes para el diagnóstico de la infección. Se desarrolló una IFI in house con células BCBL-1 inducidas con 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) para determinar la seroprevalencia. Se comparó la eficiencia de dexametasona (Dex) con TPA como inductores del ciclo lítico para IFI. Se compararon con IFI dos ELISAs basados en péptidos ramificados y quiméricos del ORF65 y ORFK8.1 para la determinación de anticuerpos. Se combinaron los resultados de cada ELISA individual para el análisis y se lo denominó PEIA, de manera que si cualquiera de los dos ELISA fuera positivo, la muestra era PEIA positiva.

Para el diagnóstico molecular en muestras de biopsias, sangre y/o saliva, se realizó la amplificación del ORF 26 por PCR directa y anidada. Para la genotipificación se secuenció la región del ORF K1 en muestras de SK, EMC, PEL y donante de órgano.

Las seroprevalencias obtenidas en dadores de sangre fueron: Córdoba, 3.4 %; Bahía Blanca, 2.4 %, Ciudad de Buenos Aires: 1.9 % (Hospital Británico) y 6.7 % (Hospital F. J. Muñiz), San Salvador de Jujuy, 10.8 %. Las prevalencias fueron bajas en Santiago de Chile (3.0 %) y Campinas, Brasil (2.8 %), mientras que en Asunción del Paraguay se encontró la mayor (13 %). En poblaciones portadoras y no portadoras de VIH las prevalencias fueron: VIH- (heterosexuales, 11.1 %; homosexuales, 32 %); VIH+ [heterosexuales no drogadictos endovenosos (no DEV), 51 %; DEV, 54 %; homosexuales 73.1 %]. Se encontró asociación entre el riesgo de infección para HHV-8 y el estado de portador de VIH, la conducta sexual (homosexuales) y la edad (ser mayor de 30 años) mediante un ensayo de regresión logística multivariado.

En la comparación de inductores para IFI, Dex fue menos citotóxica que TPA, con igual eficiencia en la producción antigénica.

La evaluación de ELISAs vs. IFI, demostró una concordancia entre ambos ensayos del 77 %, kappa 0.55 (moderado) para títulos de 1/40 (criterio de positividad para IFI); la mayor discrepancia (IFI +, PEIA -) se encontró en muestras con títulos IFI £ 1/80, indicando que los ELISAs serían apropiados para estudiar poblaciones con alto riesgo de infección, como la portadora de VIH.

Se detectó ADN viral en el 81.32 % (74/91) de enfermedades asociadas, el 26,66 % (12/45) de diagnósticos presuntivos y en 3 de 45 donantes de sangre seropositivos.

Se obtuvieron las primeras secuencias completas de la región del ORF K1 de HHV-8 en nuestro país, a partir de muestras que provenían de todo el espectro de las enfermedades asociadas (SK iatrogénico, clásico y epidémico, EMC y PEL) y un donante de hígado. El análisis filogenético permitió identificar los subtipos A, B y C, con predominancia de este último.

Las prevalencias halladas indican que Argentina, Brasil y Chile pertenecerían a una zona de prevalencia baja y Paraguay a una intermedia. En Argentina, se encontraron dos poblaciones con prevalencias mayores al resto.

El hallazgo de genoma viral en saliva indicaría que ésta podría ser una ruta de transmisión en nuestro medio. La detección del ADN viral en sangre de dadores alerta acerca de la posibilidad de transmisión por vía transfusional, aún en zonas de baja prevalencia.

Considerando la importancia de la inmigración en nuestro país, no sorprende la detección mayoritaria del subtipo C o los casos identificados de subtipo A, predominantes en Europa y Asia. En cambio, es llamativo el hallazgo del subtipo B, característico de África.

Las metodologías serológicas y moleculares desarrolladas se continuarán aplicando para estudios epidemiológicos y diagnósticos de HHV-8, con capacidad de ser transferidos a otros laboratorios.

Este estudio aporta los primeros datos de seroprevalencia y circulación de subtipos de HHV-8 en la región. Esta información podrá aplicarse para establecer programas de prevención, control y vigilancia, incluyendo una red nacional de laboratorios.

Manejo de enfermedades asociadas

• How I treat HHV8/KSHV-related diseases in posttransplant patients
  Blood. 2012 Nov 15;120(20):4150-9. doi: 10.1182/blood-2012-04-421412. Epub 2012 Sep 11. Riva G1, Luppi M, Barozzi P, Forghieri F, Potenza L.
  Posttransplantation human herpesvirus-8 (HHV8)/Kaposi sarcoma herpesvirus (KSHV) primary infection and/or reactivations are associated with uncommon and sometimes fatal, neoplastic, and non-neoplastic diseases. HHV8-related clinical manifestations notably range from Kaposi sarcoma (KS) to either primary effusion lymphoma or multicentric Castleman disease B-cell malignancies, and from polyclonal HHV8-positive plasmacytic lymphoproliferative disorders to bone marrow failure and peripheral cytopenias, associated or not with hemophagocytic syndromes, and to acute hepatitis syndromes. We reviewed the patient series reported in the literature and summarized clinical management aspects, in terms of diagnosis, follow-up, and treatment. We described typical clinical presentations and histopathologic diagnostic features of these diseases, and we discussed the role of HHV8-specific serologic, molecular, and immunologic assays, particularly focusing on recent data from HHV8-specific T-cell monitoring in posttransplantation KS patients. We finally discussed actual therapeutic options, namely, the reduction or discontinuation of immunosuppressive therapy or the switch from calcineurin inhibitors to mTOR inhibitors, as alternatives to antineoplastic chemotherapy, along with the use of antiherpesvirus agents as prophylactic or therapeutic measures, and treatment with rituximab in posttrans-plantation multicentric Castleman disease patients and non-neoplastic HHV8-associated syndromes.
• ELISPOT Principio del ensayo: El ensayo enzyme-linked immunospot (ELISpot) fue desarrollado originalmente para la detección de células B individuales que secretan anticuerpos antígeno específicos. Este método ha sido adaptado para la detección de células secretoras de citoquinas específicas o de otros antígenos. El ELISpot emplea un ELISA sandwich cuantitativo. Un anticuerpo monoclonal específico para una citoquina se coloca sobre una microplaca de PVDF (polyvinylidene difluoride). Las células debidamente estimuladas se colocan luego dentro de dichos pocillos, luego la microplaca se ubica en una estufa humidificada a 37ºC por un lapso determinado. Durante esta incubación, los anticuerpos inmovilizados en la vecindad inmediata de las células secretoras se unen a las citoquinas secretadas. Después de lavar las células y sustancias no unidas, se agrega un anticuerpo específico para las citoquinas. Después se lava para eliminar cualquier anticuerpos no unidos, se añade fosfatasa alcalina conjugada a estreptavidina. La enzima no unida se separa posteriormente mediante lavados y se añade una solución de sustrato (BCIP / NBT). Se forma un precipitado de color negro azulado en los sitios de localización de citoquinas y aparece como manchas, cada una de las cuales representa una célula individual que secreta citoquinas. Los puntos se pueden contar con sistemas automatizados de lectura de ELISpot o manualmente, usando un estereomicroscopio.